Разработан ряд методик для исследования изолированных отделов клетки. Для того чтобы выделить клеточные органеллы, исследуемый образец измельчают и затем гомогенизируют в забуференной среде с использованием гомогенизатора Поттера-Элведжема (тефлоновый пестик, вращающийся в стеклянном цилиндре). Это сравнительно мягкий метод, который особенно предпочтителен для выделения лабильных молекул и ультраструктур. Другие методики разрушения клеток включают ферментативный лизис, разрушающий клеточные стенки, или механическое разрушение замороженных тканей (размолом или с помощью вращающихся ножей; под большим давлением; осмотическим шоком; многократным чередованием замораживания и оттаивания).
Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой проводится гомогенизация, была изотонической, то есть осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут «впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.
Вслед за гомогенизацией следует фильтрование через марлю для удаления интактных клеток и соединительных тканей. Собственно фракционирование клеточных органелл проводится с помощью дифференциального центрифугирования, то есть центрифугирования при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое увеличение центробежной силы (которую принято выражать величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g = 9,81 м/с2, см. Центрифугирование) приводит к последовательному осаждению различных органелл, то есть их разделению в соответствии с плотностью и размером.
Ядро седиментирует уже при ускорении, достигаемом с помощью настольных центрифуг. Декантирование супернатанта и тщательное повторное ресуспендирование осадка даёт фракцию, обогащённую клеточными ядрами. Однако эта фракция всё ещё содержит другие клеточные компоненты в качестве примесей, например фрагменты цитоскелета.
Частицы меньших размеров и менее плотные, чем ядро, получают при воздействии на супернатант постепенно увеличивающегося ускорения . Эта операция проводится на более мощных центрифугах, таких, как высокоскоростные центрифуги с охлаждением и ультрацентрифуги. Порядок осаждения фракций следующий: митохондрии, затем мембранные пузырьки (везикулы) и рибосомы. Супернатант последнего центрифугирования представляет собой «цитозоль», то есть растворимые компоненты клетки, перешедшие при гомогенизации ткани в буферный раствор.
Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких температурах (0-5 °С) для того, чтобы уменьшить степень деградации материала за счёт реакций, катализируемых ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для защиты функциональных SH-групп от окисления.
Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой проводится гомогенизация, была изотонической, то есть осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут «впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.
Вслед за гомогенизацией следует фильтрование через марлю для удаления интактных клеток и соединительных тканей. Собственно фракционирование клеточных органелл проводится с помощью дифференциального центрифугирования, то есть центрифугирования при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое увеличение центробежной силы (которую принято выражать величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g = 9,81 м/с2, см. Центрифугирование) приводит к последовательному осаждению различных органелл, то есть их разделению в соответствии с плотностью и размером.
Ядро седиментирует уже при ускорении, достигаемом с помощью настольных центрифуг. Декантирование супернатанта и тщательное повторное ресуспендирование осадка даёт фракцию, обогащённую клеточными ядрами. Однако эта фракция всё ещё содержит другие клеточные компоненты в качестве примесей, например фрагменты цитоскелета.
Частицы меньших размеров и менее плотные, чем ядро, получают при воздействии на супернатант постепенно увеличивающегося ускорения . Эта операция проводится на более мощных центрифугах, таких, как высокоскоростные центрифуги с охлаждением и ультрацентрифуги. Порядок осаждения фракций следующий: митохондрии, затем мембранные пузырьки (везикулы) и рибосомы. Супернатант последнего центрифугирования представляет собой «цитозоль», то есть растворимые компоненты клетки, перешедшие при гомогенизации ткани в буферный раствор.
Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких температурах (0-5 °С) для того, чтобы уменьшить степень деградации материала за счёт реакций, катализируемых ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для защиты функциональных SH-групп от окисления.
Статьи раздела «Фракционирование клеточных структур»:
- А. Выделение клеточных органелл
- Б. Молекулы-маркеры
Структура:
Списки:
Сложность материала:
Величины и единицы:
Книги Список книг
Gene Control Gene Control offers an articulate, current description of how gene expression is controlled in eukaryotes, reviewing and summarizing the extensive ...
История биологической химии. Истоки науки Книга посвящена первым шагам взаимодействия химии с биологией и медициной. В ней ...
Нелинейная динамика взаимодействующих популяций Проведён анализ режимов динамического поведения в системах нескольких ...
Role of TCF in body axis formation: Discovery of a Dual Action of XTCF-3 in Xenopus Body Axis Formation A novel role of TCF family in body axis formation. Revolutionary high impact discoveries are described, elucidating the missing link in the Wnt ...