А. Выделение клеточных органелл

Разработан ряд методик для исследования изолированных отделов клетки. Для того чтобы выделить клеточные органеллы, исследуемый образец измельчают и затем гомогенизируют в забуференной среде с использованием гомогенизатора Поттера-Элведжема (тефлоновый пестик, вращающийся в стеклянном цилиндре). Это сравнительно мягкий метод, который особенно предпочтителен для выделения лабильных молекул и ультраструктур. Другие методики разрушения клеток включают ферментативный лизис, разрушающий клеточные стенки, или механическое разрушение замороженных тканей (размолом или с помощью вращающихся ножей; под большим давлением; осмотическим шоком; многократным чередованием замораживания и оттаивания).

Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой проводится гомогенизация, была изотонической, то есть осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут «впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.

Вслед за гомогенизацией следует фильтрование через марлю для удаления интактных клеток и соединительных тканей. Собственно фракционирование клеточных органелл проводится с помощью дифференциального центрифугирования, то есть центрифугирования при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое увеличение центробежной силы (которую принято выражать величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g = 9,81 м/с2, см. Центрифугирование) приводит к последовательному осаждению различных органелл, то есть их разделению в соответствии с плотностью и размером.

Ядро седиментирует уже при ускорении, достигаемом с помощью настольных центрифуг. Декантирование супернатанта и тщательное повторное ресуспендирование осадка даёт фракцию, обогащённую клеточными ядрами. Однако эта фракция всё ещё содержит другие клеточные компоненты в качестве примесей, например фрагменты цитоскелета.

Частицы меньших размеров и менее плотные, чем ядро, получают при воздействии на супернатант постепенно увеличивающегося ускорения . Эта операция проводится на более мощных центрифугах, таких, как высокоскоростные центрифуги с охлаждением и ультрацентрифуги. Порядок осаждения фракций следующий: митохондрии, затем мембранные пузырьки (везикулы) и рибосомы. Супернатант последнего центрифугирования представляет собой «цитозоль», то есть растворимые компоненты клетки, перешедшие при гомогенизации ткани в буферный раствор.

Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких температурах (0-5 °С) для того, чтобы уменьшить степень деградации материала за счёт реакций, катализируемых ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для защиты функциональных SH-групп от окисления.


Организация клетки. Структура клеток / Фракционирование клеточных структур

Статьи раздела «Фракционирование клеточных структур»:

Следущая статья   |   — Вернуться в раздел


Современные успехи химии и биологии моря / Книга Харвея, содержащая много фактического материала и интересных выводов, безусловно заслуживает внимания. В ней достаточно сжато, наглядно и ясно изложены успехи химической океанологии. В своей первой книге, «Биохимия и физика моря», Харвей лишь как бы ощупью освещал вопрос о роли бактерий в эконСовременные успехи химии и биологии моря
Книга Харвея, содержащая много фактического материала и интересных выводов, ...
Введение в молекулярную биологию / Задача предлагаемой книги состоит в ознакомлении читателей с важнейшими фактами и идеями, которыми располагает молекулярная биология на сегодняшний день.Введение в молекулярную биологию
Задача предлагаемой книги состоит в ознакомлении читателей с важнейшими фактами ...
Вычислительные устройства в биологии и медицине / В книге обобщён большой опыт, накопленный за последние годы в области применения математических методов и современной вычислительной техники в биологии и медицине. Книга состоит из трёх частей: 1. Общие сведения о применении вычислительной техники в биологии и медицине (обзор и сравнительная оценка Вычислительные устройства в биологии и медицине
В книге обобщён большой опыт, накопленный за последние годы в области применения ...
Gene Control / Gene Control offers an articulate, current description of how gene expression is controlled in eukaryotes, reviewing and summarizing the extensive primary literature into an easily accessible format. Gene Control will be of value to students in biological sciences, as well as to scientists and cliniGene Control
Gene Control offers an articulate, current description of how gene expression is controlled in eukaryotes, reviewing and summarizing the extensive ...