А. Выделение клеточных органелл

Разработан ряд методик для исследования изолированных отделов клетки. Для того чтобы выделить клеточные органеллы, исследуемый образец измельчают и затем гомогенизируют в забуференной среде с использованием гомогенизатора Поттера-Элведжема (тефлоновый пестик, вращающийся в стеклянном цилиндре). Это сравнительно мягкий метод, который особенно предпочтителен для выделения лабильных молекул и ультраструктур. Другие методики разрушения клеток включают ферментативный лизис, разрушающий клеточные стенки, или механическое разрушение замороженных тканей (размолом или с помощью вращающихся ножей; под большим давлением; осмотическим шоком; многократным чередованием замораживания и оттаивания).

Для выделения интактных органелл важно, чтобы среда, в которой проводится гомогенизация, была изотонической, то есть осмотическое давление буфера должно соответствовать давлению внутри клетки. Если раствор гипотоничен, органеллы будут «впитывать» дополнительную воду и лопнут, а в гипертонических растворах они, напротив, сморщиваются.

Вслед за гомогенизацией следует фильтрование через марлю для удаления интактных клеток и соединительных тканей. Собственно фракционирование клеточных органелл проводится с помощью дифференциального центрифугирования, то есть центрифугирования при различных скоростях вращения ротора. При этом ступенчатое увеличение центробежной силы (которую принято выражать величиной, кратной нормальному ускорению свободного падения g = 9,81 м/с², см. Центрифугирование) приводит к последовательному осаждению различных органелл, то есть их разделению в соответствии с плотностью и размером.

Ядро седиментирует уже при ускорении, достигаемом с помощью настольных центрифуг. Декантирование супернатанта и тщательное повторное ресуспендирование осадка даёт фракцию, обогащённую клеточными ядрами. Однако эта фракция всё ещё содержит другие клеточные компоненты в качестве примесей, например фрагменты цитоскелета.

Частицы меньших размеров и менее плотные, чем ядро, получают при воздействии на супернатант постепенно увеличивающегося ускорения . Эта операция проводится на более мощных центрифугах, таких, как высокоскоростные центрифуги с охлаждением и ультрацентрифуги. Порядок осаждения фракций следующий: митохондрии, затем мембранные пузырьки (везикулы) и рибосомы. Супернатант последнего центрифугирования представляет собой «цитозоль», то есть растворимые компоненты клетки, перешедшие при гомогенизации ткани в буферный раствор.

Выделение клеточных органелл обычно проводят при низких температурах (0-5 °С) для того, чтобы уменьшить степень деградации материала за счёт реакций, катализируемых ферментами; последние высвобождаются в процессе разрушения ткани. Добавление тиолов и хелатирующих агентов необходимо для защиты функциональных SH-групп от окисления.

Статьи раздела «Фракционирование клеточных структур»:

• А. Выделение клеточных органелл
• Б. Молекулы-маркеры

— Следущая статья   |   — Вернуться в раздел